小羅開(kāi)講 | 數(shù)字PCR之微反應(yīng)體系氣泡控制
轉(zhuǎn)自：羅氏診斷生命科學(xué)公眾號(hào)
大家好，本堂課小羅將帶領(lǐng)大家繼續(xù)學(xué)習(xí)數(shù)字PCR，了解微反應(yīng)體系氣泡控制對(duì)數(shù)字PCR的影響。
dPCR技術(shù)概述
數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (dPCR)，被視為第三代PCR 技術(shù)，是一種高精度的核酸檢測(cè)方法，無(wú)需校準(zhǔn)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)模板的定量。在 dPCR 中，含有目標(biāo)核酸的樣品被分為數(shù)以萬(wàn)計(jì)的分區(qū)，每個(gè)分區(qū)包含一個(gè)、幾個(gè)或沒(méi)有目標(biāo)模板。擴(kuò)增后，根據(jù)熒光強(qiáng)度將分區(qū)分為“陽(yáng)性”或“陰性”，根據(jù)泊松算法計(jì)算模板的原始濃度。
與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）相比，dPCR具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括高精度和靈敏度、無(wú)需校準(zhǔn)曲線即可對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行定量，以及檢測(cè)低濃度目標(biāo)核酸的能力。dPCR憑借其出色的性能，已廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)，包括低豐度病原基因檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異 (CNV) 分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、遺傳等位基因失衡檢測(cè)和無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè) (NIPT)等領(lǐng)域[1]。
現(xiàn)象—加熱導(dǎo)致氣泡產(chǎn)生及影響
dPCR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)上述優(yōu)異性能表現(xiàn)的關(guān)鍵步驟是生成大量統(tǒng)一的分區(qū)，通常通過(guò)兩種策略來(lái)實(shí)現(xiàn)：
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一種是基于微孔，將樣品分配到數(shù)千到數(shù)萬(wàn)個(gè)微孔腔室中；
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另一種是基于液滴的，將樣品分成皮升到納升的液滴，分散在不混溶的油中。
無(wú)論哪種分區(qū)方式，完成分區(qū)后，都要利用溫度控制模塊對(duì)所有微反應(yīng)單元進(jìn)行溫度循環(huán)以完成擴(kuò)增反應(yīng)，從而將目標(biāo)片段進(jìn)行信號(hào)放大。然而，在溫度循環(huán)中顯著的問(wèn)題是溶解在PCR反應(yīng)體系或油相中氣體的逸散，根據(jù)氣體的溶解性質(zhì)，氣體在液體中的溶解度會(huì)隨著溫度升高會(huì)大幅度降低[2]，而這一特性對(duì)數(shù)字PCR來(lái)說(shuō)，尤為重要。
圖1.（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
PCR反應(yīng)過(guò)程中伴隨著劇烈的溫度升降，由于溫度升高時(shí)氣體溶解度降低，會(huì)因脫氣（degassing）而形成微小氣泡。脫氣是芯片上聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 失敗的一個(gè)眾所周知的原因，氣泡的形成會(huì)對(duì)數(shù)字PCR反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生諸多方面的影響，如導(dǎo)致加熱不均勻，擠壓 PCR混合物從反應(yīng)室排出，出現(xiàn)的氣泡可能會(huì)取代反應(yīng)室中的乳液，以及對(duì)液滴施加剪切力，從而導(dǎo)致液滴合并等問(wèn)題，這些事件的發(fā)生均會(huì)對(duì)微孔判斷造成干擾，進(jìn)而對(duì)定量的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[3]。
圖2.（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
如何防止氣泡形成？
此前已經(jīng)有很多研究者描述了許多不同的方法來(lái)避免氣泡產(chǎn)生的問(wèn)題?？梢苑譃楸粍?dòng)和主動(dòng)方法兩大類(lèi)，使用的主要技術(shù)包括氣泡陷阱（bubble traps）、氣泡消除以及氣泡形成等方法，見(jiàn)表1。
Bubble traps通過(guò)將氣泡限制在特定區(qū)域以減少其干擾，已經(jīng)被應(yīng)用到多種微流控體系中，但該方法受溫度的影響極為明顯，高溫會(huì)導(dǎo)致氣泡劇烈膨脹，進(jìn)而導(dǎo)致擴(kuò)散，因此在溫度變化劇烈的數(shù)字PCR反應(yīng)中，該策略有明顯的局限性。
表1.（來(lái)源：羅氏診斷整理）
氣體在液體的溶解度除了受到溫度的顯著影響以外，氣壓變化也會(huì)明顯改變氣體溶解度。一般來(lái)說(shuō)，隨著氣壓的增加，氣體在液體中的溶解度會(huì)隨之升高[2]。因而，對(duì)數(shù)字PCR體系進(jìn)行系統(tǒng)加壓以增加氣體在液體中的溶解度，是預(yù)防氣泡形成的有效手段。
已有研究表明，具有主動(dòng)外部壓力產(chǎn)生的加壓系統(tǒng)可以完全避免dPCR反應(yīng)過(guò)程中氣泡產(chǎn)生的現(xiàn)象，能夠有效降低數(shù)字PCR在擴(kuò)增循環(huán)中由于溫度急劇變化帶來(lái)的氣泡形成和擴(kuò)散，進(jìn)而避免了由此導(dǎo)致的微反應(yīng)單元受損的情況，為精準(zhǔn)定量提供保障[5]。
圖3.（圖片來(lái)源：羅氏診斷整理）
此外，芯片法數(shù)字PCR技術(shù)在微孔生成的時(shí)候，由于反應(yīng)體系表面張力與芯片表面處理等原因，仍然有幾率出現(xiàn)“空泡”現(xiàn)象，即某些微孔無(wú)法被反應(yīng)體系填充，而是被氣體占位，PCR加熱過(guò)程會(huì)導(dǎo)致氣泡膨脹，會(huì)對(duì)周?chē)姆磻?yīng)孔產(chǎn)生擠壓并導(dǎo)致反應(yīng)體系的逸散，原本封閉的反應(yīng)單元無(wú)法進(jìn)行片段擴(kuò)增，將會(huì)對(duì)定量結(jié)果產(chǎn)生顯著的影響。因此，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行系統(tǒng)加壓，也是有效限制高溫導(dǎo)致的氣泡膨脹行之有效的辦法。
值得一提的是，這類(lèi)“空泡”微孔在信號(hào)采集時(shí)容易被誤認(rèn)為陰性微孔，而實(shí)際上這類(lèi)微孔不應(yīng)該被納入計(jì)算。因此，數(shù)字PCR的反應(yīng)體系具備質(zhì)控成為一個(gè)非常重要的條件，該條件可通過(guò)在體系中添加特定的熒光染料予以實(shí)現(xiàn)。擴(kuò)增完成后，應(yīng)在進(jìn)行性判斷前通過(guò)質(zhì)控染料將假陰性孔排除，再分別對(duì)進(jìn)行計(jì)數(shù)，才能通過(guò)泊松分布校正得到更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果。
參考文獻(xiàn)：
[1] dPCR: A Technology Review
[2] Chemistry: Principles, Patterns, and Applications
[3] Digital droplet PCR on disk
[4] Active liquid degassing in microfluidic systems
[5] An optimal design method for preventing air bubbles in high-temperature microfluidic devices
*僅用于科學(xué)研究，不用于臨床診斷。MC-CN-02076有效期至2025年3月25日。
