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接頭連接是二代測(cè)序文庫(kù)制備的重要環(huán)節(jié)，接頭連接效率是影響文庫(kù)質(zhì)量和產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一，它直接影響文庫(kù)的多樣性以及低頻突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性。隨著測(cè)序儀的不斷迭代，接頭設(shè)計(jì)也在不斷升級(jí)，種類更加多樣化。

接頭作為文庫(kù)的組成部分，以illumina接頭為例，一般包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列，長(zhǎng)約60bp左右（不同種類的接頭長(zhǎng)度有所不同）。其中P5/P7序列與測(cè)序芯片上的P5/P7序列互補(bǔ)，通過(guò)錨定將待測(cè)片段固定在flow cells上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增；Index又稱為樣本標(biāo)簽，目的是給文庫(kù)加上特定的標(biāo)簽，用于文庫(kù)混合測(cè)序時(shí)區(qū)分不同的文庫(kù)樣本；R1 SP/R2 SP是Read1和Read2測(cè)序引物結(jié)合的區(qū)域，在dNTP和DNA聚合酶的作用下進(jìn)行堿基延伸。接頭的一般結(jié)構(gòu)，呈“Y”字型。

羅氏測(cè)序樣本制備解決方案提供兼容illumina儀器的全套KAPA接頭產(chǎn)品組合(圖2)，按照接頭連接方式分為全長(zhǎng)接頭和截短接頭。

• 多重混樣測(cè)序時(shí)，有時(shí)會(huì)發(fā)生接頭標(biāo)簽序列錯(cuò)配的問題，進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降和結(jié)果可信度的降低。錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)主要由以下原因引發(fā)：

  1）測(cè)序儀工作時(shí)發(fā)生的標(biāo)簽跳躍/轉(zhuǎn)換現(xiàn)象

  2）標(biāo)簽試劑或者樣品間的交叉污染

  3）混合樣品在PCR擴(kuò)增時(shí)發(fā)生模板調(diào)換

  4）測(cè)序或數(shù)據(jù)分析錯(cuò)誤

• KAPA UDI接頭雙端標(biāo)簽組合在數(shù)據(jù)分析之前即可過(guò)濾掉因標(biāo)簽錯(cuò)配而產(chǎn)生的錯(cuò)誤序列，從而提升變異識(shí)別準(zhǔn)確性。

• 低頻突變檢測(cè)在腫瘤研究，特別是液體活檢研究方面至關(guān)重要，但在文庫(kù)構(gòu)建、靶向富集和測(cè)序過(guò)程中引入的突變會(huì)阻礙低頻變異檢測(cè)的準(zhǔn)確性，UMI標(biāo)簽可以對(duì)原始樣本進(jìn)行分子標(biāo)記，有利于后續(xù)在數(shù)據(jù)分析時(shí)對(duì)原始樣本進(jìn)行追蹤和分組，從而對(duì)假陽(yáng)性突變進(jìn)行校正。

• KAPA Universal UMI Adapter采用羅氏專有設(shè)計(jì)，可防止因UMI序列發(fā)生錯(cuò)誤導(dǎo)致樣本追蹤錯(cuò)誤，在性能上表現(xiàn)出高的雙鏈回收率和低的錯(cuò)誤率。

• KAPA HyperPlex接頭擴(kuò)增效率高，文庫(kù)轉(zhuǎn)化率高，可以在較少的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)下得到較高的文庫(kù)產(chǎn)量，其文庫(kù)產(chǎn)量幾乎是全長(zhǎng)接頭的兩倍。

• 滿足實(shí)驗(yàn)所需文庫(kù)產(chǎn)量的情況下，較少的擴(kuò)增循環(huán)可以增加文庫(kù)多樣性并減少PCR重復(fù)序列。