北京六一電泳-DNA電泳常見問題分析
脈沖場凝膠電泳
當雙鏈DNA分子很大，DNA雙螺旋的半徑大于凝膠的孔徑，在瓊脂糖中的電泳速度會達到極限，此時凝膠不能按照分子大小來篩分DNA,脈沖場電泳就解決了這一難題
脈沖電泳是在兩個不同方向的電場，交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內(nèi)可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。脈沖場凝膠電泳可以用來分離大小從10kb到10Mb的DNA分子
脈沖場凝膠電泳
1 儀器： WD-2101A脈沖電泳系統(tǒng)
2 配套試劑：脈沖電泳瓊脂糖(SeaKem Gold Agarose)、TBE
3 染料：GelRed等
在凝膠電泳中，溫度越高，DNA移動的速度越快，但是條帶的清晰度和分辨率會明顯下降。溫度過高會導(dǎo)致DNA帶變形或解鏈，一般設(shè)置電泳溫度為14℃
脈沖場電泳常見問題及解決辦法
1）凝膠在緩沖液中漂浮–蠕動泵的速度太快或太慢， 調(diào)到合適的速度
2）緩沖液不流動或流速慢–檢查冷卻泵：當冷卻泵制 冷時，如果蠕動泵沒有開，會造成管道內(nèi)結(jié)冰，導(dǎo) 致管道堵塞
3）電泳條帶扭曲–流速太低，導(dǎo)致制冷不充分，或不 均一、緩沖液的體積不能太小
4）條帶變粗–減少上樣量
5）條帶拖尾或模糊–電場轉(zhuǎn)換時間不合適，優(yōu)化轉(zhuǎn)換 電場轉(zhuǎn)換時間、上樣量太高，調(diào)整樣品濃度
6）大片段DNA不能有效分離–將低電壓、延長電場轉(zhuǎn)換 時間
7）條帶彎曲–緩沖液緩沖能力下降，更換緩沖液、上 樣時樣品塊被擠碎、泵速度太慢
凝膠電泳
胺凝膠有下列優(yōu)點：
1 ，凝膠透明，有彈性，機械性能好。
2 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
3 對pH和溫度變化較穩(wěn)定。
4 幾乎無電滲作用，。
5 樣品不易擴散，且用量少。
6 凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。
7 分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和 電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸 纖維薄膜電泳、瓊脂糖電 泳等有更高的分辨率。
聚丙烯酰胺凝膠聚合
聚合原理
2. 核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng) 此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。
凝膠孔徑的可調(diào)性及性質(zhì)
1凝膠的孔徑的大小是由單體和雙體在凝膠中的總濃度（T），以及雙體占總濃度的百分含量（C）即交聯(lián)度決定的。通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加
2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系： T與C不僅與凝膠的機械性能有關(guān)，還與凝膠的孔徑關(guān) 系極為密切。一般講，T濃度大，孔徑小，移動顆粒 穿過網(wǎng)孔阻力大。此外，孔徑還同Acr與Bis的比例有 關(guān)
3）凝膠濃度與被分離物相對分子量質(zhì)的關(guān)系：由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過可移動顆粒的相對分子質(zhì)量也不同。在操作時，可根據(jù)被分離物相對分子質(zhì)量大小選擇所需凝膠的濃度范圍。也可先選用7.5%凝膠(標準膠)，因為生物體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)在此范圍內(nèi)電泳均可取得較滿意的結(jié)果。如分析未知樣品時也可用4%-10%的梯度膠測試，根據(jù)分離情況選擇適宜的濃度以取得理想的分離效果。
