小羅開講 dPCR在AAV基因治療產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用
大家好，在前幾堂課內(nèi)容里面小羅和大家一起了解了關(guān)于dPCR的眾多信息。今天，小羅將帶大家了解dPCR在AAV基因治療產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用。
生物制藥迎來了基因細(xì)胞治療高速發(fā)展的時代，基因治療產(chǎn)品的原理如圖1所示【1】，其中AAV病毒載體因具有宿主范圍廣、非致病性、低免疫原性、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因、良好的擴(kuò)散性能和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床試驗中【2】。
生物制藥迎來了基因細(xì)胞治療高速發(fā)展的時代，基因治療產(chǎn)品的原理如圖1所示【1】，其中AAV病毒載體因具有宿主范圍廣、非致病性、低免疫原性、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因、良好的擴(kuò)散性能和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床試驗中【2】。
圖1. 基因治療原理
圖片來源：羅氏診斷整理
重組AAV病毒載體基因組結(jié)構(gòu)見下圖2，該載體在大規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)的過程中面臨的最大挑戰(zhàn)，是來自生產(chǎn)工藝上下游優(yōu)化和檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化。同時《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中明確指出：在保證產(chǎn)品療效的同時能有效控制產(chǎn)品免疫原性風(fēng)險，病毒載體類產(chǎn)品的規(guī)格或劑量建議以相應(yīng)體積的病毒總顆粒數(shù)或基因拷貝數(shù)表示。目前病毒載體類產(chǎn)品的基因組滴度也是確定臨床給藥劑量的重要參考，因此基因治療產(chǎn)品無論是從工藝開發(fā)，還是藥學(xué)研究，抑或是臨床試驗的過程都需要建立準(zhǔn)確的分析方法來檢測病毒載體類產(chǎn)品的基因組滴度。
圖2. 腺相關(guān)病毒（AAV）基因重組
圖片來源：羅氏診斷整理
病毒載體基因組滴度檢測的是含目標(biāo)基因組的病毒濃度，目前常用的檢測方法是實時熒光定量PCR（Q-PCR）法【3】。Q-PCR法是基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對定量的方法，它具有操作簡單，快速及成本低的優(yōu)點，但是目前也面臨巨大的挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在Q-PCR檢測的結(jié)果易受多種因素的干擾【4】，一是Q-PCR的定量依賴標(biāo)準(zhǔn)品；二是標(biāo)準(zhǔn)品與實際樣本基因組序列及結(jié)構(gòu)存在差異（如圖3和圖4）；三是標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)定的準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線存在批間差異；四是樣品中復(fù)雜化學(xué)試劑殘留，這些因素都會對病毒基因組滴度檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。
相比Q-PCR，數(shù)字PCR（dPCR）作為第三代PCR檢測技術(shù)，在核酸分子濃度檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性都有明顯的優(yōu)勢【5】【6】。實踐證明dPCR在AAV病毒載體檢測方面具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性【7】。
相比Q-PCR，數(shù)字PCR（dPCR）作為第三代PCR檢測技術(shù)，在核酸分子濃度檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性都有明顯的優(yōu)勢【5】【6】。實踐證明dPCR在AAV病毒載體檢測方面具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性【7】。
圖3. 使用不同結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)品獲得的ITR qPCR（上圖）
和SV 40 qPCR（下圖）的標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖片來源：羅氏診斷整理
圖4. ITR 不同二級結(jié)構(gòu)的ITR標(biāo)準(zhǔn)版以及
環(huán)狀質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)品對擴(kuò)增效率的影響
圖片來源：羅氏診斷整理
環(huán)狀質(zhì)粒DNA的標(biāo)準(zhǔn)品對擴(kuò)增效率的影響
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在dPCR檢測過程中，整個反應(yīng)體系被分成多個微反應(yīng)，進(jìn)行獨立擴(kuò)增，有些微反應(yīng)含有目標(biāo)分子，而有些則不含，通過檢測每個微反應(yīng)的熒光信號強(qiáng)度來判斷是否含有目標(biāo)分子，結(jié)合泊松分布統(tǒng)計原理可以直接計算出原有體系中目標(biāo)分子的濃度【8】。dPCR可直接定量目標(biāo)核酸分子，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，避免了由標(biāo)準(zhǔn)品引入的定量誤差。所以dPCR應(yīng)用在AAV病毒基因組滴度檢測的過程中，可以避免由于標(biāo)準(zhǔn)品二級結(jié)構(gòu)差異對結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的影響【7】；同時dPCR檢測法也可省去在Q-PCR檢測過程中需要對標(biāo)準(zhǔn)曲線做反復(fù)的條件摸索和優(yōu)化。
dPCR檢測過程不再是實時熒光監(jiān)測，而是終點熒光檢測，定量結(jié)果不依賴擴(kuò)增效率，對樣品中殘留物的耐受性更好【8】。這在AAV病毒載體生成過程中的基因組滴度檢測尤為重要，生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化，不同環(huán)節(jié)的滴度監(jiān)測中，實際的樣品組分多樣復(fù)雜，但都需要對載體進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，Q-PCR方法由于實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在樣品組分上存在明顯的差異，其定量的載體基因組滴度在準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性方面很難滿足生產(chǎn)需求，而dPCR檢測方法具有明顯的優(yōu)勢【7】。就目前市場上dPCR平臺按分區(qū)方式來分，大致可以分為油包水和物理分區(qū)兩種，在對樣品中殘留物的耐受性方面物理分區(qū)的方式更有優(yōu)勢【9】。在生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)的病毒載體滴度的測定中物理芯片式dPCR更適合。
與Q-PCR相比，dPCR對核酸分子拷貝數(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性更高，有更低的CV值【10】【11】，如圖5所示，分區(qū)數(shù)量越多準(zhǔn)確度越高?；蛑委熝芯侩A段需要跟蹤體內(nèi)載體濃度的變化，穩(wěn)定準(zhǔn)確的滴度才能保證準(zhǔn)確的給藥劑量，更好的指導(dǎo)臨床用藥。就臨床樣本持續(xù)定量跟蹤檢測中，dPCR結(jié)果的準(zhǔn)確度與Q-PCR方法相比明顯更優(yōu)，尤其是低濃度樣本，dPCR有較高的優(yōu)勢【12】。
dPCR檢測過程不再是實時熒光監(jiān)測，而是終點熒光檢測，定量結(jié)果不依賴擴(kuò)增效率，對樣品中殘留物的耐受性更好【8】。這在AAV病毒載體生成過程中的基因組滴度檢測尤為重要，生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化，不同環(huán)節(jié)的滴度監(jiān)測中，實際的樣品組分多樣復(fù)雜，但都需要對載體進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，Q-PCR方法由于實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在樣品組分上存在明顯的差異，其定量的載體基因組滴度在準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性方面很難滿足生產(chǎn)需求，而dPCR檢測方法具有明顯的優(yōu)勢【7】。就目前市場上dPCR平臺按分區(qū)方式來分，大致可以分為油包水和物理分區(qū)兩種，在對樣品中殘留物的耐受性方面物理分區(qū)的方式更有優(yōu)勢【9】。在生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)的病毒載體滴度的測定中物理芯片式dPCR更適合。
與Q-PCR相比，dPCR對核酸分子拷貝數(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性更高，有更低的CV值【10】【11】，如圖5所示，分區(qū)數(shù)量越多準(zhǔn)確度越高?；蛑委熝芯侩A段需要跟蹤體內(nèi)載體濃度的變化，穩(wěn)定準(zhǔn)確的滴度才能保證準(zhǔn)確的給藥劑量，更好的指導(dǎo)臨床用藥。就臨床樣本持續(xù)定量跟蹤檢測中，dPCR結(jié)果的準(zhǔn)確度與Q-PCR方法相比明顯更優(yōu)，尤其是低濃度樣本，dPCR有較高的優(yōu)勢【12】。
圖5. dPCR實驗最佳濃度范圍
圖片來源：羅氏診斷整理
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dPCR多通道的同時檢測比Q-PCR更容易實現(xiàn)，所以在細(xì)胞基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用并不局限于載體滴度檢測，如對病毒載體基因結(jié)構(gòu)的完整性，復(fù)制型病毒篩查，宿主DNA殘留等應(yīng)用領(lǐng)域也有著巨大的潛力【4】，也是很多企業(yè)和平臺方法開發(fā)的重點方向。
準(zhǔn)確快速地定量和表征AAV基因治療藥物是工藝開發(fā)和臨床申報至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，dPCR具備的無需標(biāo)準(zhǔn)品實現(xiàn)絕對定量、多通道同時檢測實現(xiàn)多維度的表征，結(jié)果重復(fù)性和靈敏度較Q-PCR具有絕對優(yōu)勢，已經(jīng)改變了基因治療產(chǎn)品的定量和表征標(biāo)準(zhǔn)，成為了行業(yè)內(nèi)必備的檢測平臺。
準(zhǔn)確快速地定量和表征AAV基因治療藥物是工藝開發(fā)和臨床申報至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，dPCR具備的無需標(biāo)準(zhǔn)品實現(xiàn)絕對定量、多通道同時檢測實現(xiàn)多維度的表征，結(jié)果重復(fù)性和靈敏度較Q-PCR具有絕對優(yōu)勢，已經(jīng)改變了基因治療產(chǎn)品的定量和表征標(biāo)準(zhǔn)，成為了行業(yè)內(nèi)必備的檢測平臺。
參考文獻(xiàn)：
1. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology volume 38, pages845–855 (2020).
2. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery volume 18, pages358–378 (2019)
3. Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards: Focus on vector genomes titration by free ITR qPCR. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development 5(C):16019.
4. PCR-Based Analytical Methods for Quantification and Quality Control of Recombinant Adeno-Associated Viral Vector Preparations. Pharmaceuticals 2022, 15, 23.
5. Principles of digital PCR and its applications in current obstetrical and gynecological diseases. Am J Transl Res. 2019; 11(12): 7209–7222.
6. Considerations for Digital PCR as an Accurate Molecular Diagnostic Tool. Clinical Chemistry 61:1 (2015).
7. Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors. Frontiers in Microbiology July 2019. Volume 10. Article 1570.
8. The Digital MIQE Guidelines Update: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments for 2020. Clinical Chemistry 66:8 (2020)
9. Droplet volume variability as a critical factor for accuracy of absolute quantification using droplet digital PCR. Anal Bioanal Chem (2017) 409:6689–6697.
10. Digital Assays Part I: Partitioning Statistics and Digital PCR. SLAS Technology 2017, Vol. 22(4) 369–386.
11. Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range and Measurement Precision. PLOS ONE March 25, 2015
12. Detection and Quantification of Chimeric Antigen Receptor Transgene Copy Number by Digital PCR versus Real-Time PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 22, No. 5, May 2020.
1. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology volume 38, pages845–855 (2020).
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12. Detection and Quantification of Chimeric Antigen Receptor Transgene Copy Number by Digital PCR versus Real-Time PCR. The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 22, No. 5, May 2020.
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